DE102011117228A1

DE102011117228A1 - Microscopy system for determining the state of cells

Info

Publication number: DE102011117228A1
Application number: DE201110117228
Authority: DE
Inventors: Dr. Velten Thomas
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2011-10-28
Filing date: 2011-10-28
Publication date: 2013-05-02
Also published as: WO2013060478A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mikroskopiesystem zur Bestimmung des Zustands von biologischen Zellen, das eine optische Bilderfassungseinheit mit einem optischen Sensor und eine optionale Beleuchtungseinheit aufweist. Die optische Bilderfassungseinheit ist von einer wasser- und feuchtedichten Umhüllung umschlossen, die über einer Sensorfläche des optischen Sensors oder zumindest einem Bereich dieser Sensorfläche durch eine optisch transparente Schicht gebildet ist. Durch die Übertragung der aufgenommenen Bilddaten von Zellen, die an der optisch transparenten Schicht anhaften, an eine externe Empfangseinheit lässt das Mikroskopiesystem zur Bestimmung des Zustands von Zellen direkt in einen Bioreaktor einsetzen.The present invention relates to a microscopy system for determining the state of biological cells comprising an optical imaging unit having an optical sensor and an optional illumination unit. The optical image acquisition unit is enclosed by a water-tight and moisture-tight envelope, which is formed over a sensor surface of the optical sensor or at least a region of this sensor surface through an optically transparent layer. By transferring the captured image data from cells adhered to the optically transparent layer to an external receiving unit, the microscopy system can be used to directly determine the state of cells in a bioreactor.

Description

Technisches AnwendungsgebietTechnical application

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mikroskopiesystem zur Bestimmung des Zustands von biologischen Zellen, das eine optische Bilderfassungseinheit mit einem optischen Sensor und eine optionale Beleuchtungseinheit aufweist. Die Erfindung betrifft auch eine Verwendung eines derartigen Mikroskopiesystems in einer von Zellen besiedelten abgeschlossenen Umgebung, beispielsweise in einem Bioreaktor.The present invention relates to a microscopy system for determining the state of biological cells comprising an optical imaging unit having an optical sensor and an optional illumination unit. The invention also relates to a use of such a microscopy system in a cell-populated sealed environment, for example in a bioreactor.

Bioreaktoren können nur dann für bakterielles Wachstum und/oder Metaboliten-Synthese effizient genutzt werden, wenn überall im Bioreaktor optimale Bedingungen für die Zellen vorliegen. Vor allem in großen Bioreaktoren herrschen allerdings nicht überall die gleichen Bedingungen (z. B. Temperatur, Nährstoffkonzentrationen, etc.). Es wäre daher erstrebenswert, den Zustand der Zellen an verschiedenen Orten innerhalb des Bioreaktors erfassen zu können. Bisher ist jedoch keine Technik bekannt, mit der der Zustand von Zellen im Bioreaktor quasi-kontinuierlich und on-line erfasst werden kann.Bioreactors can only be used efficiently for bacterial growth and / or metabolite synthesis if optimum conditions for the cells are present everywhere in the bioreactor. However, especially in large bioreactors, the same conditions do not prevail everywhere (eg temperature, nutrient concentrations, etc.). It would therefore be desirable to be able to detect the state of the cells at different locations within the bioreactor. So far, however, no technique is known with the state of cells in the bioreactor quasi-continuously and can be detected on-line.

Stand der TechnikState of the art

Heutzutage wird die Effizienz der im Bioreaktor ablaufenden Prozesse anhand der entstehenden Produkte beurteilt. Wenn die gewünschten Produkte in ausreichender Menge produziert wurden, dann wird davon ausgegangen, dass die von außen eingestellten und konstant gehaltenen Parameter (wie z. B. Temperatur) einen optimalen Zustand der Zellen ermöglichten. Der Zustand der Zellen selbst wird nicht überwacht.Nowadays, the efficiency of the processes taking place in the bioreactor is assessed on the basis of the resulting products. When the desired products have been produced in sufficient quantity, it is assumed that the parameters set externally and kept constant (such as temperature) enabled an optimal state of the cells. The state of the cells themselves is not monitored.

Eine heutige etablierte Methode um den Zustand der Zellen selbst zu messen ist die Beobachtung von Zellen mit Hilfe eines Mikroskops. Man kann z. B. aus der Teilungsrate auf die Vitalität der Zellen schließen. Außerdem kann die Zellmorphologie oder das Anhaftverhalten der Zellen als Kriterium herangezogen werden. Diese Untersuchungen sind jedoch nur außerhalb eines Bioreaktors möglich, da man nicht ein komplettes Mikroskop in einen Bioreaktor einbringen kann. Noch unmöglicher ist es mehrere Mikroskope in einen Bioreaktor zu bringen, um so den Zustand von Zellen an verschiedenen Orten des Bioreaktors zu erfassen.A current established method to measure the state of the cells themselves is the observation of cells with the help of a microscope. You can z. B. from the division rate on the vitality of the cells. In addition, the cell morphology or the attachment behavior of the cells can be used as a criterion. However, these examinations are only possible outside a bioreactor, because you can not bring a complete microscope in a bioreactor. Even more impossible is to bring several microscopes in a bioreactor, so as to detect the state of cells in different locations of the bioreactor.

Ein Konzept zur Realisierung eines sehr kompakten Mikroskopiesystems wurde von Li et al. (Wei Li; Knoll, T.; Thielecke, H.; „On-chip integrated lensless microscopy module for optical monitoring of adherent growing mammalian cells”, Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC), 2010 Annual International Conference of the IEEE, Aug. 31 2010-Sept. 4 2010, Pages 1012–1015) beschrieben. Das Mikroskopiesystem umfasst einen optischen Sensorchip und eine Beleuchtungseinheit. Zur Bestimmung des Zustands von Zellen wird ein stark miniaturisierter Bioreaktor bzw. Inkubator auf den Sensorchip aufgesetzt. Das Mikroskopiesystem befindet sich also außerhalb des Bioreaktors/Inkubators. Durch eine optisch transparente dünne Siliziumnitridmembran hindurch, die die Bodenfläche des Bioreaktors/Inkubators bildet, kann man in den Bioreaktor/Inkubator hinein schauen und auf der Siliziumnitrid-Membran anhaftende Zellen beobachten. Für den Einsatz in einem Bioreaktor ist das beschriebene System jedoch nicht geeignet.A concept for the realization of a very compact microscopy system was developed by Li et al. (Wei Li, Knoll, T., Thielecke, H .; "On-chip integrated lensless microscopy module for optical monitoring of adherent growing mammalian cells", Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC), 2010 Annual International Conference of the IEEE, Aug. 31, 2010-Sept. 4, 2010, Pages 1012-1015) described. The microscopy system comprises an optical sensor chip and a lighting unit. To determine the condition of cells, a highly miniaturized bioreactor or incubator is placed on the sensor chip. The microscopy system is thus outside the bioreactor / incubator. Through an optically transparent thin silicon nitride membrane, which forms the bottom surface of the bioreactor / incubator, one can look into the bioreactor / incubator and observe cells adhering to the silicon nitride membrane. However, the described system is not suitable for use in a bioreactor.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Mikroskopiesystem zur Bestimmung des Zustands von biologischen Zellen anzugeben, das auch in einem Bioreaktor einsetzbar ist.The object of the present invention is to provide a microscopy system for determining the state of biological cells, which can also be used in a bioreactor.

Darstellung der ErfindungPresentation of the invention

Die Aufgabe wird mit dem Mikroskopiesystem gemäß Patentanspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen des Mikroskopiesystems sind Gegenstand der abhängigen Patentansprüche oder lassen sich der nachfolgenden Beschreibung sowie den Ausführungsbeispielen entnehmen.The object is achieved with the microscopy system according to claim 1. Advantageous embodiments of the microscopy system are the subject of the dependent claims or can be found in the following description and the embodiments.

Das vorgeschlagene Mikroskopiesystem zur Bestimmung des Zustands von biologischen Zellen, das auch als Zellmikroskop angesehen werden kann, weist eine optische Bilderfassungseinheit mit einem optischen Sensor oder Detektor sowie eine optionale Beleuchtungseinheit auf. Die optische Bilderfassungseinheit ist von einer wasser- und feuchtedichten Umhüllung umschlossen, die über der Sensorfläche des optischen Sensors oder zumindest einem für die Zustandsbestimmung genutzten Bereich dieser Sensorfläche durch eine optisch transparente Schicht gebildet ist.The proposed microscopy system for determining the state of biological cells, which can also be regarded as a cell microscope, has an optical image acquisition unit with an optical sensor or detector and an optional illumination unit. The optical image acquisition unit is enclosed by a water-tight and moisture-tight envelope, which is formed above the sensor surface of the optical sensor or at least one region used for determining the state of this sensor surface by an optically transparent layer.

Bei diesem Mikroskopiesystem erfolgt die Zustandsbestimmung durch Auswertung eines mit der Bilderfassungseinheit aufgezeichneten Bildes, das durch Wechselwirkung des von der Beleuchtungseinheit abgestrahlten Lichts mit Zellen erhalten wird, die auf der optisch transparenten Schicht über der Sensorfläche aufliegen oder an dieser Schicht anhaften. In Abhängigkeit von der Lichteinstrahlung durch die Beleuchtungseinheit kann das erzeugte Bild durch Reflexion des Lichtes an den Zellen oder in Form einer Schattenprojektion der Zellen erhalten werden. Auch sekundäre Strahlung kann für die Bildaufzeichnung genutzt werden, beispielsweise von den Zellen oder mit diesen verbundenen Stoffen ausgestrahltes Lumineszenzlicht.In this microscopy system, the state determination is carried out by evaluating an image recorded by the image acquisition unit, which is obtained by interaction of the light emitted by the illumination unit with cells which rest on the optically transparent layer above the sensor surface or adhere to this layer. Depending on the light irradiation by the illumination unit, the generated image can be obtained by reflection of the light at the cells or in the form of a shadow projection of the cells. Secondary radiation can also be used for image recording, for example, luminescent light emitted by the cells or substances associated therewith.

Aufgrund der wasser- und feuchtedichten Umhüllung bzw. Verkapselung kann das Mikroskopiesystem über mehrere Tage in der von Zellen besiedelten Umgebung, insbesondere in einem Bioreaktor, verbleiben und die aufgenommenen Bilddaten an eine außerhalb dieser Umgebung befindliche Empfangseinheit übermitteln. Die Bilder können dann dargestellt und/oder geeignet ausgewertet werden, um den Zustand der Zellen beispielsweise über deren Größe oder Form zu bestimmen. vorzugsweise ist das Mikroskopiesystem hierzu mit einer drahtlosen Übertragungseinheit ausgestattet, die sich ebenfalls innerhalb der Umhüllung befindet und die mit der Bilderzeugungseinheit aufgezeichneten Bilddaten drahtlos an die externe Empfangseinheit übermitteln kann. Auch eine Energieversorgung für die einzelnen Komponenten des Mikroskopiesystems, insbesondere für die Elektronik der Bilderfassungseinheit, die Beleuchtungseinheit und die Übertragungseinheit, ist vorzugsweise ebenfalls innerhalb der Umhüllung angeordnet. Die Energieversorgungseinheit kann wiederaufladbar ausgebildet und so ausgestaltet sein, dass die Wiederaufladung durch induktives Einkoppeln von Energie von außerhalb der Umhüllung ermöglicht wird. Das Aufladen kann dann kontinuierlich während des Betriebs des Mikroskopiesystems oder jeweils nach einem Einsatz erfolgen. In einer anderen Ausgestaltung einer wiederaufladbaren Energieversorgungseinheit sind elektrische Kontakte nach außen geführt, die mit einer Ladeelektronik verbunden werden können. Die Energieversorgungseinheit lässt sich dann nach jedem Einsatz über diese Kontakte aufladen. Die Sensorfläche des optischen Sensors setzt sich in bekannter Weise aus einem zweidimensionalen Raster bzw. Array von einzelnen Detektorelementen zusammen, auch als Pixel bezeichnet.Due to the water- and moisture-tight enclosure or encapsulation can Microscopy system over several days in the cell-populated environment, in particular in a bioreactor, remain and transmit the recorded image data to a receiving unit located outside this environment. The images can then be displayed and / or suitably evaluated to determine the state of the cells, for example, their size or shape. For this purpose, the microscopy system is preferably equipped with a wireless transmission unit, which is likewise located within the enclosure and can transmit the image data recorded by the image generation unit wirelessly to the external reception unit. Also, a power supply for the individual components of the microscopy system, in particular for the electronics of the image acquisition unit, the illumination unit and the transmission unit, is preferably also disposed within the enclosure. The power supply unit can be designed to be rechargeable and designed such that the recharging is made possible by inductive coupling of energy from outside the enclosure. The charging can then take place continuously during the operation of the microscope system or after each use. In another embodiment of a rechargeable power supply unit electrical contacts are led to the outside, which can be connected to a charging electronics. The power supply unit can then be charged after each use via these contacts. The sensor surface of the optical sensor is composed in a known manner from a two-dimensional grid or array of individual detector elements, also referred to as pixels.

Die optisch transparente Schicht über der Sensorfläche muss in geringem Abstand zur Sensorfläche angeordnet und ausreichend dünn ausgebildet sein, um eine Auswertung des Zustands wie bspw. der Zellmorphologie, des Teilungsverhaltens oder des Anhaftverhaltens der aufliegenden Zellen aus dem erzeugten Bild zu ermöglichen. Vorzugsweise weist hierzu die nach außen gerichtete, d. h. von der Sensorfläche abgewandte Oberfläche der optisch transparenten Schicht einen Abstand zur Sensorfläche auf, bei dem die optische Auflösung der auf dieser Oberfläche aufliegenden Zellen bei einer Schattenprojektion durch die Größe der Pixel der Sensorfläche und nicht durch Beugungseffekte begrenzt ist. So ist bspw. die optische Auflösung R_C eines Kamerachips, wie er als optischer Sensor bei dem vorliegenden Mikroskopiesystem eingesetzt werden kann, durch die zweifache Pixelgröße S_P gegeben, d. h. R_C = 2S_P. Die Auflösung bei einer Schattenprojektion R_S ist gegeben durch

Hierbei bezeichnen d_S die Dicke der optisch transparenten Schicht, n_S den Brechungsindex dieser Schicht, d_Luft die Dicke des Luftspalts zwischen der optisch transparenten Schicht und der Sensorfläche und λ die Wellenlänge des einfallenden Lichts. Die Dicke der optisch transparenten Schicht sowie des Luftspalts sollen dabei so gewählt werden, dass bei dem gewählten Kamerachip die Auflösung durch die Pixel des Chips und nicht durch die Beugungseffekte bei der Schattenprojektion bestimmt werden. Es soll somit gelten: R_S ≤ R_C. Damit ergibt sich folgende Bedingung:

The optically transparent layer above the sensor surface must be arranged at a small distance from the sensor surface and sufficiently thin to allow an evaluation of the state, such as the cell morphology, the division behavior or the adhesion behavior of the resting cells from the generated image. For this purpose, the outwardly directed surface of the optically transparent layer, which faces away from the sensor surface, preferably has a distance from the sensor surface, in which the optical resolution of the cells resting on this surface is limited by the size of the pixels of the sensor surface and not by diffraction effects in the case of shadow projection is. Thus, for example, the optical resolution R _{C of} a camera chip, as it can be used as an optical sensor in the present microscopy system, is given by the double pixel size S _P , ie R _C = 2S _P. The resolution for a shadow projection R _S is given by

Here, d _S denote the thickness of the optically transparent layer, n _S the refractive index of this layer, d _air the thickness of the air gap between the optically transparent layer and the sensor surface and λ the wavelength of the incident light. The thickness of the optically transparent layer and the air gap should be chosen so that the resolution of the selected camera chip are determined by the pixels of the chip and not by the diffraction effects in the shadow projection. The following should apply: R _S ≤ R _C. This results in the following condition:

Die optisch transparente Schicht kann dabei selbstverständlich auch direkt oder über eine oder mehrere Zwischenschichten auf der Sensorfläche aufliegen, wobei sich eine ähnliche Beziehung ergibt, bei der lediglich der Term d_Luft wegfällt oder durch Terme d_ZSi/n_ZSi für die einzelnen Zwischenschichten i mit Dicken d_ZSi und Brechungsindizes n_ZSi ersetzt wird. Unter der optischen Transparenz ist in der vorliegenden Patentanmeldung zu verstehen, dass die Schicht in einem optischen Wellenlängenbereich transparent ist. Dies muss nicht der gesamte Wellenlängenbereich der optischen Wellenlängen sein, sondern kann einen kleineren Bereich daraus betreffen. Unter dem Wellenlängenbereich der optischen Wellenlängen ist hierbei der Bereich vom Infraroten über die sichtbaren Wellenlängen bis ins Ultraviolette zu verstehen.Of course, the optically transparent layer may also rest directly or via one or more intermediate layers on the sensor surface, resulting in a similar relationship in which only the term d _air is eliminated or by terms d _ZSi / n _ZSi for the individual intermediate _layers i with thicknesses d _ZSi and refractive indices n _{ZSi is} replaced. The optical transparency in the present patent application means that the layer is transparent in an optical wavelength range. This need not be the entire wavelength range of the optical wavelengths, but may involve a smaller range thereof. The wavelength range of the optical wavelengths is to be understood as meaning the range from the infrared via the visible wavelengths to the ultraviolet.

Das vorgeschlagene Mikroskopiesystem weist vorzugsweise keine zusätzlichen Linsen zwischen der Sensorfläche und der optisch transparenten Schicht auf, so dass das Bild der Zellen vorzugsweise als reine Schattenprojektion auf die Sensorfläche abgebildet wird. Dadurch wird das Mikroskopiesystem sehr kompakt.The proposed microscopy system preferably has no additional lenses between the sensor surface and the optically transparent layer, so that the image of the cells is preferably imaged as a pure shadow projection on the sensor surface. This makes the microscopy system very compact.

Die optisch transparente Schicht kann über eine oder mehrere Zwischenschichten direkt auf der Sensorfläche aufliegen. Die eine oder die mehreren Zwischenschichten können wiederum einen optischen Filter bilden oder umfassen, der unerwünschte Wellenlängenbereiche für die Bilderzeugung ausfiltert. Unterschiedliche Anwendungsbeispiele eines derartigen Filters sind in den nachfolgenden Ausführungsbeispielen zu finden. Die eine oder die mehreren Zwischenschichten können auch eine Einebnungsschicht umfassen, falls die Sensoroberfläche nicht plan ausgebildet ist. Dies kann bei einem Sensorchip mit integrierten Mikrolinsen der Fall sein, bei dem die Oberfläche durch die äußere Form der Mikrolinsen strukturiert ist. Durch eine Einebnungsschicht aus einem geeigneten Material, das die Unebenheiten ausgleicht, stören diese Unebenheiten nicht die Planität der optisch transparenten Schicht und ggf. einer zwischenliegenden Filterschicht oder Filterschichtfolge.The optically transparent layer can rest directly on the sensor surface via one or more intermediate layers. The one or more intermediate layers may in turn form or include an optical filter that filters out unwanted wavelength ranges for imaging. Different application examples of such a filter can be found in the following embodiments. The one or more intermediate layers may also include a leveling layer if the sensor surface is not planar. This may be the case with a sensor chip with integrated microlenses, in which the surface is structured by the outer shape of the microlenses. By a leveling layer of a suitable material that balances the bumps, disturb these bumps not the planarity of the optically transparent layer and possibly an intermediate filter layer or filter layer sequence.

Die wasser- und feuchtedichte Umhüllung ist vorzugsweise aus einem oder mehreren biokompatiblen Materialien ausgebildet oder mit einer dünnen Schicht aus biokompatiblem Material beschichtet. Durch diese biokompatible Kapselung bzw. Umhüllung ist der Einsatz innerhalb eines Bioreaktors oder einer anderen Umgebung, bspw. innerhalb eines menschlichen oder tierischen Körpers, problemlos möglich, um dort den Zustand von Zellen, bspw. das Zellwachstum, beobachten zu können. Die Umhüllung kann auch so ausgebildet sein, dass sie sich mehrmals öffnen und wieder verschließen lässt, um beispielsweise einen Batteriewechsel zu ermöglichen. In einer Ausgestaltung kann die Umhüllung hierzu aus zwei miteinander verschraubbaren Hälften mit zwischenliegender Dichtung gebildet sein.The water and moisture proof enclosure is preferably formed of one or more biocompatible materials or coated with a thin layer of biocompatible material. By means of this biocompatible encapsulation or encapsulation, the use within a bioreactor or another environment, for example within a human or animal body, is possible without difficulty in order to be able to observe there the state of cells, for example cell growth. The envelope may also be designed so that it can be opened and closed again several times, for example to allow a battery change. In one embodiment, the envelope for this purpose can be formed from two halves screwed together with an intermediate seal.

Bei dem vorgeschlagenen Verfahren zur Erfassung des Zustands von Zellen in einer von Zellen besiedelten Umgebung werden mehrere der vorgeschlagenen miniaturisierten Mikroskopiesysteme innerhalb der Umgebung angeordnet und von den optischen Sensoren erzeugte Bilddaten ausgewertet. Durch die geringe Baugröße und in sich geschlossene Ausführung der Mikroskopiesysteme lassen sich diese problemlos in einem Bioreaktor einsetzen. Vorzugsweise wird hierzu eine Ausgestaltung mit integrierter drahtloser Datenübertragungseinheit und integrierter Energieversorgung genutzt, damit keine Kabel von den Mikroskopiesystemen aus durch den Bioreaktor verlaufen, da diese eine potentielle Leckstelle sowohl für die Mikroskopiesysteme als auch für die Wand des Bioreaktors darstellen würden. Mit dem vorgeschlagenen Mikroskopiesystem sowie dem vorgeschlagenen Verfahren lassen sich Zellen in einem Bioreaktor über einen langen Zeitraum quasi-kontinuierlich beobachten bzw. mikroskopieren. Das Verfahren ermöglicht somit eine on-line Überwachung des Zustands von Zellen in einem Bioreaktor oder einer anderen offenen oder geschlossenen Umgebung.In the proposed method of detecting the state of cells in a cell-populated environment, several of the proposed miniaturized microscopy systems are placed within the environment and image data generated by the optical sensors is evaluated. Due to the small size and self-contained design of the microscopy systems, these can be used without problems in a bioreactor. For this purpose, an embodiment with integrated wireless data transmission unit and integrated power supply is preferably used, so that no cables run from the microscopy systems through the bioreactor, since these would represent a potential leak for both the microscopy systems and for the wall of the bioreactor. With the proposed microscopy system and the proposed method, cells in a bioreactor can be observed or microscoped quasi-continuously over a long period of time. The method thus allows on-line monitoring of the condition of cells in a bioreactor or other open or closed environment.

Kurze Beschreibung der ZeichnungenBrief description of the drawings

Das vorgeschlagene Verfahren und das zugehörige miniaturisierte und in sich gekapselte Mikroskopiesystem werden nachfolgend anhand eines Ausführungsbeispiels in Verbindung mit den Zeichnungen nochmals kurz erläutert. Hierbei zeigen:The proposed method and the associated miniaturized and self-contained microscopy system will be briefly explained again below with reference to an embodiment in conjunction with the drawings. Hereby show:

1 ein Beispiel eines gekapselten Mikroskopiesystems gemäß einer Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung, bei dem die Abbildung der Zellen auf den optischen Sensor mittels Schattenprojektion erfolgt; 1 an example of an encapsulated microscope system according to an embodiment of the present invention, in which the imaging of the cells on the optical sensor by means of shadow projection;

2 ein Beispiel eines gekapselten Mikroskopiesystems gemäß einer weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung, bei dem das Licht der Beleuchtungseinheit streifend auf die optisch transparente Schicht einfällt; 2 an example of an encapsulated microscope system according to another embodiment of the present invention, wherein the light of the illumination unit incident grazing on the optically transparent layer;

3 ein Beispiel eines gekapselten Mikroskopiesystems gemäß einer weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung, bei dem die optisch transparente Schicht gleichzeitig als Lichtwellenleiter fungiert; 3 an example of an encapsulated microscope system according to another embodiment of the present invention, in which the optically transparent layer functions simultaneously as an optical waveguide;

4 ein Beispiel eines gekapselten Mikroskopiesystems gemäß einer weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung bei dem zwischen der optisch transparenten Schicht und optischem Sensor ein optisches Filter verwendet wird; und 4 an example of an encapsulated microscope system according to another embodiment of the present invention wherein an optical filter is used between the optically transparent layer and the optical sensor; and

5 ein Beispiel eines gekapselten Mikroskopiesystems gemäß einer weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung, bei dem auf der optisch transparenten Schicht eine Indikatorschicht immobilisiert ist, die zur ortsaufgelösten Detektion der Konzentration eines oder mehrerer Stoffe verwendet werden kann. 5 an example of an encapsulated microscope system according to another embodiment of the present invention, in which on the optically transparent layer, an indicator layer is immobilized, which can be used for the spatially resolved detection of the concentration of one or more substances.

Wege zur Ausführung der ErfindungWays to carry out the invention

Bei den im Folgenden beschriebenen Ausführungsbeispielen wird ein extrem stark miniaturisiertes Mikroskop bestehend aus einer Beleuchtungseinheit 20, einem optischen Detektor bzw. Sensor 6, einer drahtlosen Datenübertragungseinheit 7 und einer Energieversorgungseinheit 10 aufgebaut und in ein geeignetes wasser- und feuchtedichtes sowie sterilisierbares Gehäuse 8 eingebracht. Ein solches System kann über mehrere Tage in einem Bioreaktor verbleiben und die aufgenommenen Bilddaten drahtlos an eine außerhalb des Bioreaktors befindliche Empfangseinheit 9 übermitteln. Die externe Empfangseinheit 9 kann die Bilder entweder selbst auf einem Bildschirm darstellen und/oder die Bilddaten können an einen Computer weitergeleitet werden. Das erfindungsgemäße Mikroskopiesystem in diesem Beispiel besteht somit aus einem extrem stark miniaturisierten Mikroskop, einer drahtlosen Datenübertragungseinheit, einer Energieversorgungseinheit, einem geeigneten wasser- und feuchtedichten und sterilisierbaren Gehäuse und einer außerhalb des Bioreaktors befindlichen Empfangseinheit, welche die drahtlos übermittelten Bilddaten empfängt. Die Kompaktheit des Systems wird vorzugsweise dadurch erreicht, dass das Mikroskop linsenfrei aufgebaut wird. Das Bild der Zellen wird also nicht mittels Linsen auf den optischen Detektor abgebildet. Stattdessen befindet sich unmittelbar auf dem Detektor, z. B. einem CCD-Chip, eine sehr dünne optisch transparente Schicht, auf der sich die Zellen anhaften.In the embodiments described below is an extremely highly miniaturized microscope consisting of a lighting unit 20 , an optical detector or sensor 6 , a wireless data transmission unit 7 and a power supply unit 10 constructed and in a suitable water-and moisture-tight and sterilizable housing 8th brought in. Such a system can remain in a bioreactor for several days and the captured image data wirelessly to a receiving unit located outside the bioreactor 9 to transfer. The external receiving unit 9 can either display the images themselves on a screen and / or the image data can be forwarded to a computer. The microscopy system according to the invention in this example thus consists of an extremely highly miniaturized microscope, a wireless data transmission unit, a power supply unit, a suitable water and moisture proof and sterilizable housing and a receiving unit located outside the bioreactor which receives the wirelessly transmitted image data. The compactness of the system is preferably achieved by constructing the microscope lens-free. The image of the cells is therefore not imaged by means of lenses on the optical detector. Instead, is located directly on the detector, z. As a CCD chip, a very thin optically transparent layer on which the cells adhere.

In einer ersten Ausgestaltung besteht das erfindungsgemäße System aus den in 1 gezeigten Grundkomponenten: Einer Beleuchtungseinheit 20, bestehend aus Lichtquelle 1 und einem Kollimator 2, einer optisch transparenten dünnen Schicht als Objektträger 5, einem optischen Detektor 6, einer Datenübertragungseinheit 7, einer Energieversorgungseinheit 10, einem Gehäuse 8, das wenigstens die Komponenten 5, 6, 7 und 10 umschließt, einer Befestigungsvorrichtung 3, die die Beleuchtungseinheit 20 mit dem Gehäuse 8 verbindet und einer externen Empfangseinheit 9. Die elektrischen Teile der Beleuchtungseinrichtung 20 können zusammen mit der Befestigungseinrichtung ebenfalls vom Gehäuse 8 umschlossen oder auch in einer separaten wasser- und feuchtedichten Umhüllung untergebracht sein, wobei dann die elektrische Verbindung mit der Energieversorgungseinheit 10 ebenfalls geeignet abgedichtet sein muss. In a first embodiment, the system according to the invention consists of the in 1 basic components shown: A lighting unit 20 , consisting of light source 1 and a collimator 2 , an optically transparent thin layer as a slide 5 , an optical detector 6 , a data transmission unit 7 , a power supply unit 10 , a housing 8th that at least the components 5 . 6 . 7 and 10 encloses a fastening device 3 that the lighting unit 20 with the housing 8th connects and an external receiving unit 9 , The electrical parts of the lighting device 20 can also, together with the fastening device from the housing 8th enclosed or even housed in a separate water-and moisture-tight enclosure, in which case the electrical connection to the power supply unit 10 must also be suitably sealed.

Nach Einbringen dieses Systems in einen Bioreaktor setzen sich im Bioreaktor befindliche Zellen auf dem System, vor allem aber auf dem Objektträger 5 ab. Das Bild der Zellen auf dem optischen Detektor 6 entsteht vorzugsweise durch Schattenprojektion. Dazu wird das Licht einer nahezu punktförmigen Lichtquelle 1 (z. B. LED) mittels einer geeigneten Vorrichtung, eines sogenannten Kollimators 2, der beispielsweise als wenige Zentimeter langes dünnes Röhrchen mit geschwärzter Innenwand ausgeführt sein kann, parallelisiert und auf die auf dem Objektträger 5 befindlichen Zellen geleitet. Der Lichteinfall erfolgt vorzugsweise senkrecht zur Fläche des Objektträgers 5, d. h. vorzugsweise parallel zur Normalen auf dem Objektträger 5. Die Schatten der Zellen werden von dem unmittelbar unter dem Objektträger 5 befindlichen optischen Detektor 6 detektiert. Um den Einfluss von Beugungseffekten auf die Bildqualität zu minimieren, wird der Abstand zwischen Zellen und optischem Detektor 6 sehr gering gehalten. Dies wird vorzugsweise dadurch erreicht, dass der Objektträger 5 sehr dünn ist.Upon introduction of this system into a bioreactor, cells in the bioreactor sit on the system, but especially on the slide 5 from. The image of the cells on the optical detector 6 is preferably created by shadow projection. For this purpose, the light of a nearly punctiform light source 1 (eg LED) by means of a suitable device, a so-called collimator 2 , which may for example be designed as a few centimeters long thin tube with blackened inner wall, parallelized and on to the slide 5 passed cells. The incidence of light is preferably perpendicular to the surface of the slide 5 , ie preferably parallel to the normal on the slide 5 , The shadows of the cells are from just below the slide 5 located optical detector 6 detected. To minimize the influence of diffraction effects on image quality, the distance between cells and optical detector becomes 6 kept very low. This is preferably achieved in that the slide 5 is very thin.

Der Objektträger 5 kann z. B. als ca. 1 μm dünne Siliziumnitridschicht ausgeführt sein. Diese kann beispielsweise realisiert werden, indem mittels PECVD (Plasma Enhanced Chemical Vapour Deposition) Siliziumnitrid mit der gewünschten Dicke (z. B. ca. 1 μm) auf einem Substrat, z. B. auf einem Siliziumwafer, abgeschieden wird. In dem Bereich in dem sich später der optische Detektor 6 befinden soll, wird das Substrat mittels eines Ätzprozesses (im Falle eines Siliziumsubstrats z. B. durch nasschemisches Ätzen mit Kaliumhydroxidlauge) selektiv entfernt. Es resultiert eine Siliziumnitridmembran der gewünschten Größe, welche von einem Siliziumrahmen oder einem Rahmen eines anderen Materials umgeben ist. Dieser Rahmen ist in 1 als Substrat 4 bezeichnet. Die lateralen Abmessungen des Substrats 4 (z. B. eines Siliziumrahmens) können mittels einer geeigneten Vorrichtung, z. B. mittels einer Wafersäge, auf die gewünschte Größe gebracht werden. Das Substrat 4 erleichtert das Handhaben des extrem dünnen Objektträgers 5 und kann verwendet werden, um den Objektträger 5 mit dem Gehäuse 8 des Gesamtsystems zu verbinden. Ein weiteres bevorzugtes Substratmaterial ist Metall. Vorzugsweise besteht das Metallsubstrat aus dem gleichen Material wie das Gehäuse 8 des miniaturisierten Mikroskopiesystems.The slide 5 can z. B. be designed as about 1 micron thin silicon nitride. This can be realized, for example, by using silicon dioxide (PECVD) of the desired thickness (for example, about 1 .mu.m) on a substrate, for example, PECVD (Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition). B. on a silicon wafer is deposited. In the area in which later the optical detector 6 The substrate is selectively removed by means of an etching process (in the case of a silicon substrate, eg by wet-chemical etching with potassium hydroxide solution). The result is a silicon nitride membrane of the desired size, which is surrounded by a silicon frame or a frame of another material. This frame is in 1 as a substrate 4 designated. The lateral dimensions of the substrate 4 (eg a silicon frame) may be obtained by means of a suitable device, e.g. B. by means of a wafer saw, are brought to the desired size. The substrate 4 facilitates the handling of the extremely thin slide 5 and can be used to slide 5 with the housing 8th of the overall system. Another preferred substrate material is metal. Preferably, the metal substrate is made of the same material as the housing 8th of the miniaturized microscope system.

In einer weiteren erfindungsgemäßen und in 2 skizzierten Ausgestaltung erfolgt der Lichteinfall nicht senkrecht zum Objektträger 5. Stattdessen ist die Lichtquelle 1 der Beleuchtungseinheit so angeordnet, dass der Lichtstrahl 21 streifend auf den Objektträger 5 fällt. Der Lichtstrahl 21 kann weiterhin durch eine geeignet geformte Blende, die beispielsweise spaltförmig ausgeführt ist (nicht dargestellt), begrenzt werden. Bei streifendem Einfall hat die Reflektivität des Objektträgers 5 nahezu den Wert 1, d. h. das direkt von der Lichtquelle kommende Licht kann praktisch nicht durch den Objektträger 5 hindurchtreten und kann daher den optischen Detektor 6 nicht erreichen. Lediglich das Licht, das an den auf dem Objektträger 5 befindlichen Zellen reflektiert oder gestreut wird, ist in der Lage, den optischen Detektor 6 zu erreichen. Das vom optischen Detektor 6 aufgenommene Bild enthält also Informationen über die auf dem Objektträger 5 anhaftenden Zellen. Durch eine räumliche Begrenzung des Lichtstrahls werden nur die unmittelbar auf dem Objektträger 5 sitzenden Zellen bestrahlt, so dass nur von diesen Licht in Richtung des optischen Detektors 6 gestreut oder reflektiert werden kann.In another invention and in 2 sketched embodiment, the light does not occur perpendicular to the slide 5 , Instead, the light source is 1 the lighting unit is arranged so that the light beam 21 grazing on the slide 5 falls. The light beam 21 can also be limited by a suitably shaped aperture, which is for example designed in a slit shape (not shown). When grazing incidence has the reflectivity of the slide 5 almost the value 1, ie the light coming directly from the light source can not practically through the slide 5 can pass through and therefore the optical detector 6 do not reach. Only the light that is on the slide 5 is reflected or scattered cells is capable of, the optical detector 6 to reach. That of the optical detector 6 captured image thus contains information about the on the slide 5 adherent cells. Due to a spatial limitation of the light beam only those directly on the slide will be 5 irradiated sedentary cells, leaving only this light in the direction of the optical detector 6 scattered or reflected.

Diese Methode der streifenden Beleuchtung hat den Vorteil, dass das Gesamtsystem noch kompakter aufgebaut werden kann als das in 1 gezeigte System.This method of grazing illumination has the advantage that the overall system can be made even more compact than that in 1 shown system.

In einer weiteren erfindungsgemäßen und in 3 dargestellten Ausgestaltung wird das Licht der Lichtquelle 1 der Beleuchtungseinheit in geeigneter Weise in den sehr dünnen Objektträger 5 eingekoppelt. Der Objektträger 5 erfüllt den Zweck eines optischen Lichtwellenleiters und leitet das Licht. Die Lichteinkopplung, welche mit Hilfe einer Einkoppelvorrichtung 22 vorgenommen wird, kann mit bekannten Methoden erfolgen. Dazu zählt beispielsweise das Einkoppeln mittels Prismen oder mittels geeigneter Gitterstrukturen, sogenannter Gitterkoppler. Es ist bekannt, dass sich das elektromagnetische Feld des in einem Wellenleiter geführten Lichts nicht vollständig im Wellenleiter befindet. Ein Teil des elektromagnetischen Felds ragt auch aus dem Wellenleiter heraus, z. B. in den Bioreaktor. Dies ist bekannt als das sogenannte „evaneszente Wellenfeld”. Dieses evaneszente Wellenfeld klingt exponentiell mit dem Abstand ab und ragt typischerweise nur Bruchteile eines Mikrometers aus dem Wellenleiter heraus. Im Bioreaktor trifft es entweder auf an dem Objektträger 5 anhaftende Teile einer Zelle oder auf Flüssigkeit. Ein Teil dieses Lichts wird an den Zellen gestreut oder reflektiert und Teile des gestreuten oder reflektierten Lichts erreichen den optischen Detektor 6 und ergeben dort ein Bild, das eine Aussage über das Anhaftverhalten der Zellen auf dem Objektträger 5 ermöglicht. Eine Beobachtung des Anhaftverhaltens über einen längeren Zeitraum gibt weiterhin Informationen über die Bewegung der Zellen auf dem Objektträger 5. Anhand des Anhaftmusters ist weiterhin eine Zellteilung erkennbar. Man kann so also auch eine Aussage über das Proliferationsverhalten der Zellen gewinnen.In another invention and in 3 illustrated embodiment, the light of the light source 1 the illumination unit suitably in the very thin slide 5 coupled. The slide 5 fulfills the purpose of an optical fiber and conducts the light. The light coupling, which by means of a coupling device 22 is made, can be done by known methods. This includes, for example, the coupling by means of prisms or by means of suitable grating structures, so-called grating couplers. It is known that the electromagnetic field of the light guided in a waveguide is not completely in the waveguide. Part of the electromagnetic field also protrudes out of the waveguide, e.g. B. in the bioreactor. This is known as the so-called "evanescent wave field". This evanescent wave field decays exponentially with distance and typically protrudes only fractions of a micron out of the waveguide. in the Bioreactor either encounters it on the slide 5 adherent parts of a cell or on liquid. Part of this light is scattered or reflected at the cells and parts of the scattered or reflected light reach the optical detector 6 and give it a picture that gives a statement about the adherence of the cells on the slide 5 allows. An observation of adherence behavior over a longer period of time also provides information about the movement of the cells on the slide 5 , Based on the adhesion pattern, a cell division is still recognizable. So you can also gain a statement about the proliferation behavior of the cells.

In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Mikroskopiesystems gemäß 4 befindet sich zwischen den zu beobachtenden Zellen und dem optischen Detektor 6 ein optisches Filter 23, um Licht bestimmter Wellenlängen herauszufiltern oder durchzulassen. Beispielsweise können solche Filter aus mehreren übereinanderliegenden dünnen dielektrischen Schichten bestehen (Interferenzfilter) und mittels geeigneter Dünnschichttechnik hergestellt sein. Vorzugsweise befindet sich das optische Filter 23 direkt auf einer Seite des dünnen Objektträgers 5. Die Filterschichten werden vorzugsweise direkt auf dem Objektträger 5 abgeschieden. In einer weiteren bevorzugten Anordnung werden die Filterschichten direkt auf dem optischen Detektor 6 abgeschieden.In a further preferred embodiment of the microscopy system according to the invention 4 is located between the cells to be observed and the optical detector 6 an optical filter 23 to filter out or transmit light of specific wavelengths. For example, such filters can consist of a plurality of superimposed thin dielectric layers (interference filter) and be produced by means of suitable thin-film technology. Preferably, the optical filter is located 23 directly on one side of the thin slide 5 , The filter layers are preferably directly on the slide 5 deposited. In a further preferred arrangement, the filter layers are directly on the optical detector 6 deposited.

Als optische Detektoren 6 können beispielsweise kommerziell erhältliche CCD-Chips eingesetzt werden. Diese sind üblicherweise mit einer Vielzahl mikroskopisch kleiner Linsen (Mikrolinsen) versehen. Daraus resultiert eine sehr unebene Oberfläche des CCD-Chips. Werden die optischen Filterschichten direkt auf den Mikrolinsen abgeschieden, so trifft ein senkrecht zum CCD-Chip einfallender Lichtstrahl aufgrund der gekrümmten Oberflächen der Mikrolinsen an verschiedenen Orten unter einem unterschiedlichen Winkel auf die Filterschichten. Dadurch ist die effektiv in den Filterschichten durchlaufene optische Weglänge ebenfalls von Ort zu Ort verschieden. Dies resultiert in einer von Ort zu Ort verschiedenen Filterwirkung. In einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Mikroskopiesystems wird daher auf die Mikrolinsen des CCD-Chips zunächst eine dünne optisch transparente Schicht 24 aufgebracht, die einen einebnenden Effekt hat. Daraus resultiert eine relativ ebene Oberfläche. Die Dicke dieser Einebnungsschicht 24 soll vorzugsweise im Bereich weniger Mikrometer liegen. In einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Mikroskopiesystems werden die Filterschichten 23 auf die Einebnungsschicht 24 aufgebracht. Vorzugsweise besteht die Einebnungsschicht 24 aus einem relativ weichen Polymermaterial, das sich beim Andrücken des Objektträgers 5 an diesen anschmiegt. Auf diese Weise wird verhindert, dass sich zwischen der Einebnungsschicht 24 und dem Objektträger 5 kleine Hohlräume befinden, die sich mit einem Medium füllen, das einen anderen optischen Brechungsindex hat als das einebnende Material selbst. Alternativ können diese Hohlräume mit einem Material, z. B. einer geeigneten Flüssigkeit, gefüllt werden, das den gleichen Brechungsindex hat wie das einebnende Material oder wie der verwendete Objektträger 5 (z. B. Siliziumnitridschicht). In der Optik sind solche Flüssigkeiten als „Immersionsöl” bekannt. Falls auf die Einebnungsschicht 24 verzichtet wird, so sollten die sich zwischen den Mikrolinsen und dem dünnen Objektträger 5 (z. B. Siliziumnitridschicht) bildenden kleinen Hohlräume mit einem Material wie z. B. einer geeigneten Flüssigkeit gefüllt werden, das den gleichen Brechungsindex hat wie das Material der Mikrolinsen oder wie der verwendete Objektträger 5.As optical detectors 6 For example, commercially available CCD chips can be used. These are usually provided with a plurality of microscopic lenses (microlenses). This results in a very uneven surface of the CCD chip. If the optical filter layers are deposited directly on the microlenses, a light beam incident perpendicularly to the CCD chip impinges on the filter layers at different locations due to the curved surfaces of the microlenses. As a result, the optical path length effectively traversed in the filter layers is also different from place to place. This results in a filter effect different from place to place. In a preferred embodiment of the microscopy system according to the invention, therefore, a thin optically transparent layer is first applied to the microlenses of the CCD chip 24 Applied, which has a leveling effect. This results in a relatively flat surface. The thickness of this leveling layer 24 should preferably be in the range of a few micrometers. In a preferred embodiment of the microscopy system according to the invention, the filter layers 23 on the leveling layer 24 applied. Preferably, the leveling layer exists 24 made of a relatively soft polymer material that sticks when pressed against the slide 5 clings to these. In this way it prevents being between the leveling layer 24 and the slide 5 small voids which are filled with a medium having a different optical refractive index than the planarizing material itself. Alternatively, these voids may be filled with a material, e.g. As a suitable liquid, filled, which has the same refractive index as the planarizing material or as the slide used 5 (eg silicon nitride layer). In optics, such liquids are known as "immersion oil". If on the leveling layer 24 is omitted, which should be between the microlenses and the thin slide 5 (For example, silicon nitride layer) forming small cavities with a material such. B. a suitable liquid, which has the same refractive index as the material of the microlenses or as the slide used 5 ,

In einer weiteren möglichen Ausgestaltung besteht das optische Filter 23 aus einer eigenständigen dünnen Folie (Polymer oder Glas) und wird zwischen Objektträger 5 und CCD-Chip bzw. zwischen Objektträger 5 und Einebnungsschicht 24 eingebracht, z. B. eingelegt, eingeklemmt oder eingeklebt. Auch in diesem Fall können sich die zwischen dem Filter 23 und der Einebnungsschicht 24 bzw. zwischen dem Filter 23 und den Mikrolinsen bildenden Hohlräume mit einem Material, z. B. einer geeigneten Flüssigkeit, gefüllt werden, das den gleichen Brechungsindex hat wie das einebnende Material bzw. wie die Mikrolinsen.In a further possible embodiment, the optical filter 23 made of a self-contained thin film (polymer or glass) and placed between slides 5 and CCD chip or between slides 5 and leveling layer 24 introduced, z. B. inserted, clamped or glued. Also in this case, those between the filter can 23 and the leveling layer 24 or between the filter 23 and the microlens forming cavities with a material, for. B. a suitable liquid to be filled, which has the same refractive index as the planarizing material or as the microlenses.

Die Verwendung der beschriebenen optischen Filter 23 kann vorteilhaft eingesetzt werden, wenn zusätzlich oder alternativ zum Bild der Zellen weitere optische Effekte, wie z. B. eine Lumineszenz, detektiert werden soll. Beispielsweise können zumindest einige der Zellen im Bioreaktor mit sogenannten Fluoreszenzmarkern versehen sein, die entweder von vorn herein vorhanden sind, oder erst beim Eintreten einer bestimmten Situation in der Zelle gebildet werden. Die Fluoreszenzmarker leuchten nicht von sich aus, sondern werden üblicherweise mit Photonen zum Leuchten angeregt (Photolumineszenz). In diesem Fall können die oben beschriebenen optischen Filter 23 dazu verwendet werden, um das Anregungslicht, das von einer Lichtquelle 1 des erfindungsgemäßen Mikroskopiesystems oder auch von einer davon unabhängigen Lichtquelle stammen kann, herauszufiltern und nur die entstandene Lumineszenz zu dem optischen Detektor 6 durchzulassen. Falls eine Lichtquelle 1 des Mikroskopiesystems verwendet werden soll, so sind alle oben genannten Konfigurationen (Licht fällt senkrecht auf den Objektträger 5, Licht fällt streifend auf den Objektträger 5, Objektträger fungiert als Lichtwellenleiter, in den das Anregungslicht eingekoppelt wird) verwendbar.The use of the described optical filters 23 can be used advantageously if in addition to or as an alternative to the image of the cells further optical effects such. B. a luminescence to be detected. For example, at least some of the cells in the bioreactor can be provided with so-called fluorescent markers, which are present either from the outset, or are formed only when a specific situation occurs in the cell. The fluorescence markers do not light up, but are usually excited by photons (photoluminescence). In this case, the above-described optical filters 23 used to stimulate the light coming from a light source 1 of the microscopy system according to the invention or else originate from a light source independent thereof and filter out only the resulting luminescence to the optical detector 6 pass. If a light source 1 of the microscopy system, so are all the above configurations (light falls perpendicular to the slide 5 , Light grazing on the slide 5 , Slide acts as an optical waveguide into which the excitation light is coupled) usable.

Weiterhin kann das erfindungsgemäße Mikroskopiesystem zur Detektion einer Chemolumineszenz oder einer in den Zellen auftretenden Biolumineszenz verwendet werden. In diesen letzteren Fällen ist kein Anregungslicht zum Anregen der Lumineszenz nötig. Ein erfindungsgemäßes Mikroskopiesystem zum Detektieren einer Chemo- oder Biolumineszenz kann also ohne eigene Lichtquelle 1 bzw. Beleuchtungseinheit aufgebaut sein. Selbstverständlich kann bei Nutzung einer Beleuchtungseinheit neben der Chemo- oder Biolumineszenz auch ein Bild der Zellen detektiert werden. Furthermore, the microscopy system according to the invention can be used to detect chemiluminescence or bioluminescence occurring in the cells. In these latter cases, no excitation light is necessary for exciting the luminescence. An inventive microscopy system for detecting a chemo- or bioluminescence can therefore without its own light source 1 or lighting unit to be constructed. Of course, when using a lighting unit in addition to the chemo- or bioluminescence also an image of the cells can be detected.

In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausgestaltung gemäß 5 ist der Objektträger 5 mit einer dünnen Schicht eines Indikatormoleküls versehen, dessen Lumineszenzverhalten von der Anwesenheit bestimmter Stoffe oder von dem pH-Wert oder der Temperatur der unmittelbaren Umgebung abhängt. Vorzugsweise sind die Indikatormoleküle in eine Polymermatrix eingebettet, um ein ortsfestes Verbleiben der Indikatormoleküle auf der Objektträgeroberfläche auch über einen längeren Zeitraum zu gewährleisten. Zum Aufbringen als dünne Schicht, wird beispielsweise das Polymermaterial zusammen mit den Indikatormolekülen in einem Lösemittel gelöst und die resultierende Flüssigkeit mit Methoden wie Aufschleudern, Aufsprühen, Drucken oder einer anderen dem Fachmann bekannten Methode auf die Oberfläche des Objektträgers 5 aufgebracht. Nach dem Verdunsten des Lösemittels bildet sich ein fester Polymerfilm, in den die Indikatormoleküle eingebettet sind. Eine solche Methode ist z. B. in M. Staal, E. I. Prest, J. S. Vrouwenvelder, L. F. Rickelt, M. Kühl: „A simple optode based method for imaging O2 distribution and dynamics in tap water biofilms”, waterresearch 45 (2011) pp. 5027–5037 für den Fall sauerstoff-sensitiver Indikatormoleküle beschrieben. Bei der dort beschriebenen Methode wurde Ruthenium(II)-tris-4,7-diphenyl-1,10-phenanthroline (Ru-dpp) in einer Polystyrolmatrix immobilisiert. Als Lösemittel kam Chloroform zum Einsatz.In a further embodiment according to the invention 5 is the slide 5 provided with a thin layer of an indicator molecule whose luminescence behavior depends on the presence of certain substances or on the pH or temperature of the immediate environment. Preferably, the indicator molecules are embedded in a polymer matrix in order to ensure a fixed retention of the indicator molecules on the slide surface, even over an extended period of time. For application as a thin layer, for example, the polymer material is dissolved together with the indicator molecules in a solvent and the resulting liquid by methods such spin-on, spray, print or other method known in the art on the surface of the slide 5 applied. After evaporation of the solvent, a solid polymer film is formed in which the indicator molecules are embedded. Such a method is z. In M. Staal, EI Prest, JS Vrouwenvelder, LF Rickelt, M. Kuhl: "A simple optode-based method for imaging O2 distribution and dynamics in tap water biofilms", waterresearch 45 (2011) pp. 5027-5037 described in the case of oxygen-sensitive indicator molecules. In the method described there, ruthenium (II) tris-4,7-diphenyl-1,10-phenanthroline (Ru-dpp) was immobilized in a polystyrene matrix. The solvent used was chloroform.

Ein so hergestellter Indikatorfilm 25 hat vorzugsweise eine Schichtdicke von unter 10 μm, vorzugsweise unter 5 μm, um die ortsaufgelöste Detektion des Stoffes, für den das verwendete Indikatormolekül sensitiv ist, mit einer hohen räumlichen Auflösung zu ermöglichen. Es soll hier noch einmal darauf hingewiesen werden, dass die Anwendung nicht auf die Detektion von Sauerstoff beschränkt ist. Bei Verwendung eines entsprechenden Indikatormoleküls können auch Indikatorschichten 25 hergestellt werden, die zur Detektion anderer Stoffe, wie z. B. Glukose, Laktat oder weitere Stoffe, geeignet sind. Weiterhin muss die Indikatorschicht nicht als notwendigerweise als homogene Schicht, sondern kann auch als strukturierte Schicht auf den Objektträger 5 aufgebracht werden. Dazu können beispielsweise fotolithografische Methoden eingesetzt werden, wie sie aus der Mikrosystemtechnik bekannt sind. Bei Verwendung einer Drucktechnik zum Aufbringen der Indikatorschicht, kann die Indikatorschicht schon beim Drucken als strukturierte Schicht realisiert werden. Drucktechniken, die unter diese Erfindung fallen beinhalten z. B. Tiefdruck, Hochdruck, Offsetdruck, Tampondruck sowie das sogenannte „micro contact printing”, welches speziell für die Realisierung von Mikrostrukturen entwickelt wurde. Die Erfindung ist jedoch nicht nur auf die genannten Drucktechniken beschränkt. Sehr vorteilhaft können beispielsweise Strukturen in Form eines Streifenmusters eingesetzt werden, wobei die Struktur im einfachsten Fall aus einem einzigen beschichteten Streifen und einem benachbarten nicht beschichteten Streifen besteht. Weiterhin bevorzugt besteht die Struktur aus einzelnen Kreisen oder Rechtecken. Vorzugsweise haben die Kreise oder Rechtecke etwa die Größe eines einzelnen lichtsensitiven Pixels des optischen Detektors 6 (z. B. CCD-Chip) oder ein ganzzahliges Vielfaches dieser Größe. Die nicht beschichteten Stellen können beispielsweise als Referenz dienen, d. h. die Intensität der von den beschichteten Stellen kommenden Lumineszenz und die von den unbeschichteten Stellen kommende Lumineszenz können getrennt detektiert werden. Das eigentliche Messsignal kann dann aus den beiden getrennt voneinander gemessenen Einzelwerten berechnet werden. Bei der Berechnung kann es vorteilhaft sein, das Verhältnis zwischen den im beschichteten Bereich und dem Referenzbereich gemessenen Lumineszenzintensitäten zu bilden.A thus produced indicator film 25 preferably has a layer thickness of less than 10 microns, preferably less than 5 microns to allow the spatially resolved detection of the substance for which the indicator molecule used is sensitive, with a high spatial resolution. It should be pointed out once again that the application is not limited to the detection of oxygen. If a corresponding indicator molecule is used, indicator layers can also be used 25 are prepared for the detection of other substances, such. As glucose, lactate or other substances are suitable. Furthermore, the indicator layer does not necessarily have to be considered a homogenous layer, but may also be a structured layer on the slide 5 be applied. For this purpose, for example, photolithographic methods can be used, as they are known from microsystem technology. When using a printing technique for applying the indicator layer, the indicator layer can already be realized as a structured layer during printing. Printing techniques that fall under this invention include e.g. As gravure, high pressure, offset printing, pad printing and the so-called "micro contact printing", which was developed specifically for the realization of microstructures. However, the invention is not limited only to the mentioned printing techniques. For example, structures in the form of a stripe pattern can be used very advantageously, the structure in the simplest case consisting of a single coated strip and an adjacent uncoated strip. Further preferably, the structure consists of individual circles or rectangles. Preferably, the circles or rectangles are about the size of a single light-sensitive pixel of the optical detector 6 (eg CCD chip) or an integer multiple of this size. The uncoated sites can serve as a reference, for example, ie the intensity of the luminescence coming from the coated sites and the luminescence coming from the uncoated sites can be detected separately. The actual measurement signal can then be calculated from the two individual values measured separately from one another. In the calculation, it may be advantageous to form the ratio between the luminescence intensities measured in the coated region and the reference region.

Zum gleichzeitigen Messen mehrerer Stoffe oder Größen (z. B. Temperatur, pH-Wert) kann die Indikatorschicht 25 aus Bereichen verschiedener Indikatorstoffe bestehen. Auch hier können, neben den für die verschiedenen Stoffe sensitiven Bereichen, weitere Bereiche angeordnet werden, die keine Indikatormoleküle enthalten und somit als Referenz diesen können.For simultaneous measurement of several substances or quantities (eg temperature, pH value), the indicator layer 25 consist of areas of different indicator substances. Here too, in addition to the areas sensitive to the various substances, further regions can be arranged which contain no indicator molecules and can therefore be used as a reference.

Bei den bisherigen Ausführungen wurde davon ausgegangen, dass die Konzentration des nachzuweisenden Stoffes ortsaufgelöst detektiert werden soll. Mittels einer alternativen Detektionsmethode kann auch ein über den gesamten Objektträger 5 gemittelter Wert der Stoffkonzentration detektiert werden. Dabei wird über alle mit dem jeweiligen Indikatormolekül beschichteten Bereiche gemittelt und außerdem über alle Referenzbereiche gemittelt. In diesem Fall ist es vorteilhaft, die Referenzbereiche und die Messbereiche ineinander zu verschachteln. Bei Verwendung eines Indikatormoleküls für den Stoff A, eines Indikatormoleküls für den Stoff B und eines Referenzbereichs (R) sollten bei Verwendung eines Streifenmusters die Streifen in der sich immer fortlaufenden Reihenfolge ABRABRABR usw. auf dem Objektträger 5 angeordnet sein. Auf diese Art der Anordnung lassen sich Einflüsse von Inhomogenitäten der Stoffkonzentration oder der Temperaturverteilung auf die Mittelwerte der Stoffkonzentrationen reduzieren.In the previous statements, it was assumed that the concentration of the substance to be detected should be detected in a spatially resolved manner. An alternative detection method can also be used over the entire slide 5 averaged value of the substance concentration can be detected. It is averaged over all coated with the respective indicator molecule areas and also averaged over all reference ranges. In this case it is advantageous to nest the reference areas and the measuring areas. When using an indicator molecule for substance A, an indicator molecule for substance B and a reference region (R), when using a stripe pattern, the strips should be in the consecutive order ABRABRABR, etc. on the slide 5 be arranged. On this type of arrangement, influences of inhomogeneities of Reduce the substance concentration or the temperature distribution to the mean values of the substance concentrations.

Zum optischen Anregen einer Lumineszenz sind alle in den 1, 2 und 3 beschriebenen Konfigurationen der Lichtquelle verwendbar. Außerdem können die in den 4 und 5 gezeigten optischen Filter 23 zum Abblocken des Anregungslichts vorteilhaft eingesetzt werden.For optically exciting a luminescence, all are in the 1 . 2 and 3 described configurations of the light source usable. In addition, the in the 4 and 5 shown optical filter 23 be used to block the excitation light advantageous.

Zur drahtlosen Übertragung der von dem optischen Detektor 6 als Bilderfassungseinheit aufgenommenen Bilddaten sind prinzipiell alle heute bekannten Datenübertragungsmethoden verwendbar. Dazu gehört z. B. die Verwendung von Funk oder auch optische Methoden. Entsprechende standardisierte Übertragungsmodule und -protokolle sind in großer Anzahl vorhanden. Bei der Übertragung per Funk können beispielsweise ZigBee, Bluetooth, WLAN oder MICS Standard verwendet werden. Bei einer optischen Übertragung kann beispielsweise das IrDA (Infrared Data Association) Protokoll verwendet werden. Die kommerziell erhältlichen Datenübertragungsmodule sind üblicherweise mit einem Mikrocontroller ausgestattet. Dieser kann zur Steuerung des Ablaufs einer Bilderfassungs- und übertragungssequenz eingesetzt werden.For wireless transmission of the from the optical detector 6 In principle, image data recorded as an image acquisition unit can be used for all data transmission methods known today. This includes z. B. the use of radio or optical methods. Corresponding standardized transmission modules and protocols are present in large numbers. When transmitting by radio, for example, ZigBee, Bluetooth, WLAN or MICS standard can be used. In an optical transmission, for example, the IrDA (Infrared Data Association) protocol can be used. The commercially available data transmission modules are usually equipped with a microcontroller. This can be used to control the flow of an image acquisition and transmission sequence.

Zum Schutz des Mikroskopiesystems vor Flüssigkeiten und Feuchte muss dieses sowie die Datenübertragungseinheit 7 in geeigneter Weise gekapselt werden. Geeignete Verfahren, Gehäusetechniken und -materialien sind beispielsweise aus dem Bereich der aktiven medizinischen Implantate (z. B. Herzschrittmacher) bekannt. Das Gehäuse 8 ist vorzugsweise aus Metall, vorzugsweise einem Metall, das die Forderung nach Biokompatibilität (z. B. gemäß ISO 10993 1–20 ) erfüllt. Vorzugsweise sollten alle mit den Zellen im Bioreaktor in Kontakt kommenden Materialien eine Biokompatibilität gemäß ISO 10993 1–20 aufweisen. Ein geeignetes Metall ist z. B. Titan. Da der Objektträger 5 unmittelbar mit Zellen in Kontakt kommen und somit einen Teil des Gehäuses bilden muss, ist der Objektträger 5 bzw. das Substrat 4, auf dem der dünne Objektträger 5 abgeschieden ist, in geeigneter Weise mit dem restlichen Gehäuse 8 zu verbinden. Dazu können Methoden wie Schweißen (z. B. Laserschweißen), Löten oder Kleben eingesetzt werden. Zur Gewährleistung der Biokompatibilität kann beispielsweise das komplette System mit einer dünnen Schicht eines optisch transparenten und biokompatiblen Materials beschichtet werden. Ein geeignetes Material ist beispielsweise Parylene C. Eine geeignete Dicke der Schutzschicht kann beispielsweise 1–5 μPm betragen.To protect the microscope system from liquids and moisture this and the data transmission unit must 7 be encapsulated in a suitable manner. Suitable methods, packaging techniques and materials are known, for example, from the field of active medical implants (eg pacemakers). The housing 8th is preferably made of metal, preferably a metal that satisfies the requirement for biocompatibility (e.g. ISO 10993 1-20 ) Fulfills. Preferably, all materials contacting the cells in the bioreactor should have biocompatibility according to ISO 10993 1-20 exhibit. A suitable metal is z. For example titanium. As the slide 5 To come into direct contact with cells and thus form part of the housing is the slide 5 or the substrate 4 on which the thin slide 5 is deposited, suitably with the rest of the housing 8th connect to. For this purpose, methods such as welding (eg laser welding), soldering or gluing can be used. To ensure biocompatibility, for example, the entire system can be coated with a thin layer of an optically transparent and biocompatible material. A suitable material is, for example, Parylene C. A suitable thickness of the protective layer may be, for example, 1-5 μPm.

Bei Verwendung einer optischen Datenübertragungsmethode ist das Gehäuse 8 vorzugsweise mit einem optischen Fenster versehen. Hierzu kann beispielsweise Glas eingesetzt werden, das mittels einer der oben beschriebenen Verfahren mit dem restlichen Gehäuse verbunden wird. Im Falle einer Datenübertragung mittels elektromagnetischer Wellen wird üblicherweise eine Antenne eingesetzt. Diese sollte vorzugsweise außerhalb des Gehäuses angeordnet sein, da sich vor allem im Falle eines Metallgehäuses eine starke Dämpfung der elektromagnetischen Wellen ergeben würde. Die elektrische Verbindung zwischen Elektronik (innerhalb des Gehäuses) und Antenne (außerhalb des Gehäuses) kann beispielsweise mittels sogenannter Glas- oder Keramikdurchführungen realisiert werden. Diese sind meist so ausgeführt, dass sie direkt in ein Metallgehäuse eingeschweißt werden können. Alternativ können auch hier die oben bereits genannten Verfahren Löten und Kleben eingesetzt werden. Die Antenne selbst kann beispielsweise mittels einer dünnen Parylene C-Schicht überzogen werden. Alternativ oder zusätzlich kann die Antenne in biokompatibles Silikon eingebettet werden.When using an optical data transmission method, the housing is 8th preferably provided with an optical window. For this purpose, for example, glass can be used, which is connected by means of one of the methods described above with the rest of the housing. In the case of data transmission by means of electromagnetic waves, an antenna is usually used. This should preferably be arranged outside of the housing, since a strong attenuation of the electromagnetic waves would result, especially in the case of a metal housing. The electrical connection between electronics (inside the housing) and antenna (outside the housing) can be realized for example by means of so-called glass or ceramic bushings. These are usually designed so that they can be welded directly into a metal housing. Alternatively, the above-mentioned methods soldering and gluing can also be used here. The antenna itself can be coated, for example, by means of a thin Parylene C layer. Alternatively or additionally, the antenna can be embedded in biocompatible silicone.

Die Energieversorgung des erfindungsgemäßen Systems kann mittels einer Batterie erfolgen. Beispielsweise kann eine Batterie verwendet werden, wie sie auch bei aktiven medizinischen Implantaten, bspsw. Herzschrittmacher, eingesetzt wird.The energy supply of the system according to the invention can be effected by means of a battery. For example, a battery can be used, as with active medical implants, eg. Pacemaker, is used.

Die Erfindung ist nicht auf die offenbarten Ausführungsbeispiele eingeschränkt. Auch andere Variationen können vom Fachmann hieraus abgeleitet werden, ohne den Schutzumfang der Erfindung zu verlassen. So muss beispielsweise die Beleuchtungseinheit nicht zwangsläufig mit der Bilderzeugungseinheit bzw. dessen Gehäuse oder Umhüllung verbunden sein, sondern kann auch eine separate Einheit mit eigener Stromversorgung bilden. Die Ausgestaltungen der einzelnen Ausführungsbeispiele können auch miteinander kombiniert werden.The invention is not limited to the disclosed embodiments. Other variations can be deduced therefrom by those skilled in the art without departing from the scope of the invention. For example, the lighting unit need not necessarily be connected to the image forming unit or its housing or enclosure, but may also form a separate unit with its own power supply. The embodiments of the individual embodiments can also be combined with each other.

BezugszeichenlisteLIST OF REFERENCE NUMBERS

11: Lichtquellelight source
22: Kollimatorcollimator
33: Befestigungsvorrichtungfastening device
44: Substratsubstratum
55: Objektträgerslides
66: optischer Sensoroptical sensor
77: DatenübertragungseinheitData transfer unit
88th: Gehäusecasing
99: externe Empfangseinheitexternal receiving unit
1010: EnergieversorgungseinheitPower supply unit
2020: Beleuchtungseinheitlighting unit
2121: streifend einfallender Lichtstrahlgrazing light beam
2222: Einkoppelvorrichtungcoupling device
2323: optisches Filteroptical filter
2424: Einebnungsschichtplanarization
2525: Indikatorfilmindicator film

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.This list of the documents listed by the applicant has been generated automatically and is included solely for the better information of the reader. The list is not part of the German patent or utility model application. The DPMA assumes no liability for any errors or omissions.

Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

Li et al. (Wei Li, Knoll, T., Thielecke, H .; "On-chip integrated lensless microscopy module for optical monitoring of adherent growing mammalian cells", Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC), 2010 Annual International Conference of the IEEE, Aug. 31, 2010-Sept. 4, 2010, Pages 1012-1015) [0005]
M. Staal, EI Prest, JS Vrouwenvelder, LF Rickelt, M. Kühl: "A simple optode-based method for imaging O2 distribution and dynamics in tap water biofilms", waterresearch 45 (2011) pp. 5027-5037 [0035]
ISO 10993 1-20 [0041]
ISO 10993 1-20 [0041]

Claims

Microscopy system for determining the state of cells comprising an optical image acquisition unit with an optical sensor ( 6 ) and an optional lighting unit ( 20 ), characterized in that the optical image acquisition unit of a water and moisture-tight envelope ( 8th ) which is located above a sensor surface of the optical sensor ( 6 ) or at least a portion of this sensor surface through an optically transparent layer ( 5 ) is formed.

Microscopy system according to claim 1, characterized in that a surface remote from the sensor surface of the optically transparent layer ( 5 ) has a distance to the sensor surface, in which a shadow projection of surface-mounted cells on the sensor surface enables an optical resolution that is determined by a pixel size of pixels of the optical sensor ( 6 ) is determined.

Microscopy system according to claim 1 or 2, characterized in that the optically transparent layer ( 5 ) rests directly or via one or more optically transparent intermediate layers on the sensor surface.

Microscopy system according to claim 3, characterized in that the one or more intermediate layers comprise one or more optical filters ( 23 ) form or comprise.

Microscopy system according to claim 3 or 4, characterized in that one of the one or more intermediate layers comprises a leveling layer ( 24 ) forms a surface structure of the sensor surface.

Microscopy system according to one of claims 1 to 5, characterized in that a wireless data transmission unit ( 7 ) in the envelope ( 8th ) is arranged with the image data generated by the image acquisition unit to an external receiving unit ( 9 ) can be transmitted.

Microscopy system according to one of claims 1 to 6, characterized in that a power supply unit ( 10 ) for the optical image acquisition unit and the illumination unit ( 20 ) and optionally the wireless data transmission unit ( 7 ) in the envelope ( 8th ) is arranged.

Microscopy system according to one of claims 1 to 7, characterized in that the illumination unit is arranged so that a shadow projection of on the optically transparent layer ( 5 ) resting cells on the sensor surface.

Microscopy system according to one of claims 1 to 7, characterized in that the illumination unit ( 20 ) is arranged so that a grazing incidence of light on the optically transparent layer ( 5 ) he follows.

Microscopy system according to one of claims 1 to 7, characterized in that the optically transparent layer ( 5 ) is designed as an optical waveguide and the lighting unit ( 20 ) is arranged and formed so that it couples light into the optical waveguide.

Microscopy system according to one of claims 1 to 10, characterized in that a layer with indicator molecules ( 25 ) at least in sections on the optically transparent layer ( 5 ) is applied.

Microscopy system according to one of claims 1 to 11, characterized in that the envelope ( 8th ) formed from biocompatible materials or coated with a layer of a biocompatible material.

Method for detecting the state of cells in a cell-populated environment, in particular in a bioreactor, in which one or more of the microscopy systems according to one or more of the preceding claims are arranged within the environment and image data generated by the microscopy systems is evaluated.